“全球抗疫”系列讲座｜《mRNA疫苗的优化和应用与基于循环肿瘤DNA的癌症早起检测及技术进展》（附精彩视频）

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导读 本期美国浙江商会联合中美健康峰会、全球绿色发展联盟、治理研究所共同主办的“全球抗疫系列”讲座将聊聊新冠疫苗研发和癌症诊断。蓝鹊生物的mRNA疫苗是首个在体内表达病毒颗粒的新冠疫苗，刚发表了一篇Cell Research。Avida Biomed的肿瘤诊断筛查是基于循环肿瘤DNA，是一种非侵入式“液体活检”。

主讲嘉宾：王冰博士，Grace Zhao

王冰博士是上海蓝鹊生物医药有限公司的首席运营官。

Grace Zhao是Avida Biomed Inc.联合创始人和临床研究负责人。

本文经此次讲座内容整理而成。

讲座大纲

mRNA疫苗的优化与应用 – 首个体内表达新冠病毒样颗粒的mRNA疫苗

· mRNA疫苗的背景和开发关键

· mRNA疫苗的优化方向

· 蓝鹊mRNA疫苗研发进展 基于循环肿瘤DNA的癌症早期检测及技术进展

主要观点 《mRNA疫苗的优化与应用 – 首个体内表达新冠病毒样颗粒的mRNA疫苗》

mRNA疫苗的背景和开发关键

mRNA药物作为新一代药物开发的突破点，基于从DNA到RNA到蛋白质的中心法则，导入体内的是mRNA，发挥疗效是其编码的蛋白质。

mRNA疫苗颠覆现有传染病疫苗研发范式。迄今为止病毒灭火疫苗研发的最短时间为5年，而新冠疫苗的目标是在18个月以内完成研发。mRNA疫苗不需要使用活病毒作为载体，相对比较安全，所以可以从完成安全性和有效性测试后，直接进入大规模生产。美国mRNA疫苗创下记录：在40天内完成从拿到序列到进入临床批次生产。“即插即用”的mRNA技术储备将成为应对大规模传染病爆发的利器。

国内mRNA药物产业化面临瓶颈、原材料缺乏和产业化技术空白等问题，在大规模疫苗需求面前显得非常突出。需要从底层原料出发，解决mRNA新药开发“卡脖子”难题。

作为国内公司，一方面需要丰富mRNA研发的工具箱，做mRNA分子本身的优化，开发完整mRNA药物生产工艺，扩大生产规模，另一方面需要尽快实现核心原料国产化、严格控制生产成本、确保国家生物安全。 mRNA疫苗的优化方向

mRNA 分子优化筛选过程中，理想的mRNA分子需要具有表达力强、半衰期长和低免疫原性的特点。

mRNA的结构及对应优化方向主要分为以下几个部分：

Cap modifications：帽子类似物以提高mRNA稳定性和翻译效率。

编码区：密码子优化以提高翻译效率；碱基优化以减少核酸内切酶的攻击。 5’UTR：提高翻译起始效率。

3’UTR：序列元件介导涉及mRNA转运和翻译的调控；序列抑制mRNA的脱腺苷酸化；组织特异性。

转录mRNA优化过程中可以使用修饰核苷酸以减少天然免疫的激活同时可以对mRNA二级结构优化以提高稳定性。

总结来说就是针对修饰核苷酸、帽子结构、编码区、UTR选择四个方向进行优化。

修饰核苷酸可以减少免疫原性、减少细胞毒性、提高表达效率、提高稳定性。蓝鹊目前可以合成20+种修饰核苷酸并且具备新型分子改造能力。

帽子结构中，Cap1存在于所有真核生物mRNA且是机体区分自身与外源RNA的重要特征。缺乏cap结构修饰的mRNA会被认为是外部入侵的mRNA，会激活先天免疫导致mRNA降解无法发挥功能。蓝鹊目前采用化学加帽法合成帽子类似物，可合成近10种帽子类似物，并且具备新型分子改造能力，保证加帽效率达到90%以上。

编码区优化方向包括密码子、GC含量、Codon Adaptation Index(CAI)、Minimum Free Energy (MFE)、螺旋长度、二级结构等。蓝鹊开发独有AI算法进行编码区优化。

通过UTR选择，来进行mRNA优化。5’UTR和3’UTR的序列均影响mRNA的稳定性及蛋白表达量。蓝鹊筛选上万种UTR组合以寻找适用于mRNA优化改造的组合。

蓝鹊还开发串联mRNA表达平台。多条mRNA分别合成与包装，最终在一条mRNA上表达多个蛋白。在新冠病毒样颗粒表达中需要三种不同mRNA。mRNA表达平台低序列长度、低结构程度、高效介导表达的特点使其在病毒样颗粒表达中成为关键。

在转录长mRNA片段过程中，通过酶的定向进化，解决mRNA长片段合成问题，提高mRNA得率和纯度。

mRNA单独分子带有高负电荷，需要进行正确的包装才可以进入体内。通过阳离子脂分子和胆固醇包裹形成脂质体纳米颗粒中和其负电性。蓝鹊使用高通量3D筛选平台，高效快速筛选复合材料。 蓝鹊mRNA疫苗研发进展

蓝鹊针对COVID-19的mRNA疫苗有两种设计。2月初，蓝鹊在体外利用mRNA表达病毒衣壳蛋白，首次成功实现了SARS-COV-2病毒样颗粒的表达。

蓝鹊针对COVID-19的mRNA疫苗表达筛选进行了序列密码子优化和mRNA加帽和修饰优化。同时还采用蓝鹊自主研发的脂纳米组装装置进行了包装。在小鼠免疫试验中，RQ3013(VLP) 疫苗可诱导产生更多的中和抗体。RQ3012(Spike)疫苗诱导产生中和抗体滴度与Moderna疫苗类似。

蓝鹊疫苗生产研发与疫苗开发同步进行。目前已经完成mRNA疫苗剂型改善，正在准备进行动物攻毒实验。工艺和原材料开发也在同步进行，确保疫苗生产规模扩大。原料和药物生产均采用平台化模式，将过程流程化最终获得高纯度mRNA和mRNA药物制剂。

视频实录：mRNA疫苗的优化与应用 – 首个体内表达新冠病毒样颗粒的mRNA疫苗

《基于循环肿瘤DNA的癌症早 期 检测及技术进展》

2020年，癌症将夺走60万人的生命，并有180万的新增病人会确诊。而在这些癌症相关的死亡案例中，有71%的癌症是没有早筛手段的。目前只有5种癌症相关的常规检查。如果癌症能早期被检出，5年存活率会得到极大的提高。

人们经常会问为什么很多药物在小鼠试验效果很好，运用到人体后效果就不是很理想，过不了临床3期试验。这主要是因为人的肿瘤太大了，尤其是晚期的肿瘤不光大而且癌症细胞的突变也相当多样化很难用一种药物来解决问题。但是如果在肿瘤很小的时候开始治疗，治疗的成功率就会极大提高。

鉴于DNA的变异是癌症发病的关键，检测DNA上面的变化就顺理成章的成为现代分子检测的核心。在寻找无创癌症检测的过程中，人们探索过很多肿瘤标志物，比如蛋白、循环肿瘤细胞、免疫细胞代谢物等各种各样的标志物。

但是相对于传统的影像学和细胞形态学来说这种利用血液的液态活检，它的适用性更高、依从性更强而且可以普及到各种癌症。最受资本和工业界关注的癌症分子检测方法是以循环肿瘤DNA为主的技术。循环肿瘤DNA，即ctDNA，是肿瘤细胞的凋亡时释放到血液里或者其他体液的小片段DNA。这种DNA带有癌症的特征标志。可以通过检测这种标志来间接检测癌症。而DNA上带的这个癌症的标志物可以是遗传学方面，比如说点突变或者是

表观遗传学上方面，比如说甲基化，甚至是循环DNA的长短也有人用作检测指标之一。

目前由于没有很好的癌症筛查手段，大部分病人在确诊的时候几乎都是晚期导致很高的死亡率。如果用循环肿瘤DNA作为检测手段，理论上是可以适用于任何一种癌症的。同时，只需要抽一管血，依从性也会很高。Grail认为根据他们的早期血液诊断可以提高早期的检出率， 这样每年可以挽救10万人的生命。

根据illumina的估算，基于循环肿瘤DNA癌症早期检测可以比现有的检测技术多发现3倍以上的病人。这些潜在的癌症早筛、以及现在已经逐渐被广泛接受的晚期癌症病人指导用药、以及复发监测，将会在2035年将二代测序癌症检测市场推向价值750亿美元。二代测序，或者说NGS，这种技术可以实现几百到几百万靶点的评估。相对于市面上盛行的qPCR以单位数靶点检测的手段，是一种从广度和深度水平上明显的技术提升。对于灵敏度要求不高的晚期癌症这种靶点检测NGS有很大的优势，在于它同时可以检测很多药物靶点。而对于灵敏度要求极高的检测，理论上同时看的靶点越多，测序越深，检测灵敏度越高。但检测成本也是NGS主要考虑的因素，因为相对比较昂贵检测的深度和广度需要合理设计同时会受到测试成本的限制。

近半年来基于循环肿瘤DNA进行癌症检测的公司有很多大动作。以做结直肠粪便检测为主的Exact Sciences前几天第一次公布了他们多种癌症的血液检测数据和规划。

每个公司都有自己的特有的技术。目前主要癌症早筛公司都借助于循环肿瘤DNA甲基化的分析检测，比如说Grail，放弃了点突变的检测专注于甲基化检测。Exact Sciences和Guardant Health都用到了甲基化而且结合了点突变和蛋白组学的多组学。

一个实用技术应该是准确，易用且不能太贵。因为在美国，检测需要保险公司付账。

早筛和微小残留病检测对于检测方法的灵敏度要求非常高，因为循环肿瘤DNA的含量可能只有0.01%。如果利用点突变作为肿瘤标志物，可利用的数目是非常有限的。在一个固定panel低浓度的情况下检出循环肿瘤DNA会非常困难。但是甲基化靶点正好相反，他们的变化非常统一，导致每次检出可以利用的靶点提高到几十上百。

目前的甲基化检测主要分两大阵营，一个是以检测几个靶点为主的PCR技术。发展比较早，但是靶点少，灵敏度低，早期的癌症检出率有待提高。另一个是全基因组，或者是很大的靶点组合，比如10万靶点的测序。问题是高覆盖面增加了灵敏度但成本也会相应较高。且每靶点就不可能测的非常深。目前只专注于肿瘤靶点，经济又有深度的测序技术，靠市场上现有的技术是还不能完美实现的。

AVIDA Biomed是致力于NGS应用技术研发的公司。AVIDA技术被取名为Point-n-Seq，取名借鉴了“傻瓜相机”Point-n-Shoot的意义，即指向准确，简单实用且经济实惠。Avida的核心技术是一个非常高效的DNA富集技术。这个技术可以支持“精”和“准”的甲基化的panel研究。现有的甲基化富集技术一般都只能支持大的panel。小panel测序成本可以降到大panel的测序成本的接近10%，但是捕捉靶点的效率提高了10-20倍。该技术同时简化了很多操作步骤，把DNA富集这一步从需要10小时以上缩减到一个小时，极大地提高了操作易用性和加快了出结果的速度。

Point-n-Seq利用相对小且集中的一个panel可以非常深的测序，可以准确地检测到10万分之3含量的肿瘤DNA，比文献所报道最好的灵敏度提高了至少10倍，支持早筛和微小残留病所需要的灵敏度。

Point-n-Seq在一个小规模测试中的早期结直肠癌检测检出率是92%。二期以上的检出率可以做到100%。而对于癌前病变的检出，能做到63%，与市场上基于粪便的结直肠癌检测敏感度不相上下。

Point-n-Seq技术在保持高灵敏的前提下，虽然采用了NGS技术，但是它的成本几乎和基于粪便和qPCR检测的Cologuard（在美国接近10亿美元的年销售额）的成本持平，保证有一定的竞争力且比较容易纳入保险。而除了结直肠癌，Avida也在探索肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌以及胰腺癌的检测。

Avida的Point-n-Seq将在2021年先作为RUO（科研产品）试剂盒推向市场，从而支持微小残留病和早筛领域的临床研究者，以及药厂进行临床研究，和伴随诊断试剂开发。同时也会通过客户定制解决方案的形式，支持大的临床实验室开发自有产品。为了适应临床诊断试剂需求，自动化试剂盒目前也在开发阶段。

视频实录：基于循环肿瘤DNA的癌症早期检测及技术进展

排版&校对：Kiki Yuan

内容 整理 ： 孙沛伦

内容复审：王冰、Grace Zhao

图片和视频来源：讲座实录